WB条带杂？这锅谁来背？ ✦✦✦ 目的蛋白有多个修饰位点？ 样本处理有问题？ 抗体问题？ 洗膜不充分？ 二抗与抗原交叉反应？ 还是发光液质量有问题？ 其实， 我们往往忽略了真正的罪魁祸首——封闭
下面亲和带大家从原理到实践深度解读封闭，解决WB实验中背景多、条带杂的难题。
为什么要封闭？ ✦✦✦
封闭（Blocking）简而言之就是把NC膜或者PVDF膜上没有目的蛋白的地方堵上，不留死角，不给一抗、二抗躲猫猫的空间。抗体想要留在膜上除非结合到目的蛋白，抓紧目的蛋白，否则后续三次漂洗（Wash）的过程中，go with the wind。
封闭的核心要点是? ✦✦✦ 盖住除目的蛋白以外的所有位置，只让抗体结合目的蛋白，增加实验准确性。
3.为什么脱脂奶粉和BSA 不是封闭的首选？ ✦ 由于历史的原因，早期的实验先驱们先找到了脱脂奶粉和BSA来封闭，虽然脱脂奶粉和BSA能起到占据膜上空位的作用，但是脱脂奶粉和BSA都是来源于生物体，从标品纯度（99%-99.9%）看，其中混有至少0.1%-1%的杂质，且杂质成分不单一，可能有几百几千种蛋白构成，这么多的杂蛋白难免与一抗、二抗勾勾搭搭，非特异地结合。出现了如下背景杂，多条带的结果： 所以： 条件容许的情况下，避免使用脱脂奶粉及BSA； 首先脱脂奶粉及BSA需要精挑细选。原因在于脱脂奶粉及BSA都是动物源的，纯度一般为99%，哪怕再高一个数量级99.9%，杂质含量仍有0.1%。重点来了！！！试想0.1%的杂质有多少未知因素？含有多少种蛋白？多少种细胞因子？是不是与一抗，二抗非特异结合？这些因素都可能埋下祸根，造成最终结果的背景不干净。甚至有些无良商家脂类还没有脱干净，造成抗体的非特异吸附，造成背景一片黑、条带杂和诡异的斑点。 另外， 检测磷酸化抗体时，若磷酸化修饰的位点在酪氨酸上，则不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。
如何做好封闭？ ✦✦✦ ✦ 摇床选择 ✦ 在摇床的选择上，一定要使用跷板摇床（左右摇像跷跷板一样） 不要使用圆周摇床，因为圆周摇床转圈圈的方式，会产生离心力，导致样品分布不均或者膜变形或者破损。 ✦ 封闭液选择 ✦ 随着科技的发展，材料学突飞猛进，已经有了高分子合成材料代替BSA和脱脂奶粉了。高分子合成材料优点是： 非动物来源，成分单一明确，不与抗体非特异结合； 以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于膜上，这种结合牢固。两者双管齐下保证了NC膜/PVDF膜背景干干净净。 MinuteBlock快速低背景封闭液 (MinuteBlock Blocking Buffer) 是新一代的即用型封闭液，采用独特配方，仅用5-10min即可快速高效地封闭NC/PVDF膜上空余的结合位点，阻止抗体与膜之间的非特异结合，有效地降低了背景，提高了信噪比，封闭效果显著优于传统的封闭液及其它同类封闭液。 该封闭液使用有机合成高聚物替代传统BSA、脱脂奶粉，避免了内源性杂质产生的污染和非特异结合的风险，因而背景更低。同时相比BSA、脱脂奶粉，本品与膜结合能力更强，缩短了封闭时间，从而加速了WesternBlot的实验进程。 另外MinuteBlock封闭液中不含有毒的叠氮钠、硫柳汞，不会干扰HRP 活性，安全系数高。本品适配磷酸化、乙酰化、甲基化、生物素化蛋白的检测。
（从左至右依次为脱脂奶粉、BSA、封闭液）
（封闭液可申请试用）
封闭时间？ ✦✦✦
